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美研| CMC系列(十三):X射线粉末衍射法在药物晶型定性分析中的应用

2024-04-28
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开篇引言

药物固态表征方法有很多,X射线粉末衍射(XRPD)、热重分析(TGA)、差示扫描量热(DSC)、红外(IR)、拉曼(Raman)、固态核磁(ssNMR)、动态水分吸附(DVS)、热台显微镜、扫描电镜(SEM)、偏振光显微镜(PLM)。其中,XRPD凭借快速、直观、样品用量少,样品不被破坏可回收的优点,已成为药物晶型研究的首选表征方法及金标准,广泛用于药物固态的定性和定量等研究,贯穿药物固态研究的各个阶段。

FDA Guidance: X-ray powder diffraction can also be used to provide unequivocal proof of polymorphism.

i. 《中国药典》2020年版第四部0451专门阐述了药品研究中X射线衍射法的应用;9015则指明了药品晶型研究及晶型质量控制。
ii. 美国药典(USP)941章节介绍了有关Characterization of Crystalline and Partially Crystalline Solids by X-Ray Powder Diffraction (XRPD)。
iii. 欧洲药典(EP 10.8)在《5.9 Polymorphism》和《5.16 Crystallinity》中对晶型定义阐明了XRPD用于药物晶型表征。
iv. 日本药典(JP XVII)中收录了晶型描述以及XRPD表征方法。

01 X射线衍射法和原理

X射线衍射法(XRPD, X-ray powder diffraction)是一种利用单色X射线光束照射到被测样品上,检测样品的三维立体结构(含手性、晶型、结晶水或结晶溶剂)或成分(主成分及杂质成分、晶型种类及含量)的分析方法。其原理是:X射线是一种高能电磁波,能够穿透物质并与其中的原子或者分子产生相互作用。当X射线照射原子排列规律不同的固体时,会产生不同的衍射图谱。因此,不同晶型的XRPD谱图往往差异很大,具有指纹属性,易于区分,如图1所示。

图1-几何测量原理图.jpg

图1. 几何测量原理图

02 X射线粉末衍射(XRPD)图的组成

X射线粉末衍射图是化合物结构参数间接信息,变化万千,随物质结构不同而异。那么,该如何解读衍射图?

组成X射线粉末衍射图的三要素为:峰位、峰强、峰形(线形)。衍射峰强受晶体结构、样品特性(择优取向、吸收、孔隙率)和仪器参数影响。晶型是由化合物的晶胞参数(a,b,c,a,β,γ)定义的,而晶胞参数(a,b,c,a,β,γ)影响的是衍射峰的峰位置。其他检测指标如峰强度,则由原子参数决定,并受到择优取向的影响。

因此,判断晶型一致性时,取决于药物晶型衍射峰的位置,而不是衍射峰的强度或强弱顺序。

判断晶型一致性时,取决于药物晶型衍射峰的位置,而不是衍射峰的强度或强弱顺序.jpg

03 X射线粉末衍射(XRPD)的应用

1、区分晶态物质和非晶态物质(无定型)

中国药典2020版0451指出,晶态物质的粉末X射线粉末衍射峰是由数十乃至上百个锐峰(窄峰)组成;而非晶态物质的粉末X射线粉末衍射峰的数量较少且呈弥散状(为宽峰或馒头峰),如图2所示。

图2-某一化合物结晶态和无定型的XRPD对比图.jpg

图2.某一化合物结晶态和无定型的XRPD对比图

2、鉴别多晶型

当某一化合物有两种或两种以上的不同固体物质状态时,即存在有多晶型(或称为同质异晶)现象。

多晶型现象可以由样品的分子构象、分子排列规律、分子作用力等变化引起,也可由结晶水或结晶溶剂的加人(数量与种类)形成。不同晶型的XRPD图在衍射峰数量、衍射峰位置、衍射峰强度以及衍射峰的形状上显现出差异。

化合物的每一种晶型都会产生一种特有的X射线粉末衍射图,XRPD图可以作为晶体的指纹图谱,用于鉴定区分不同晶型,如图3所示。

图3-某一化合物不同晶型的XRPD对比图.jpg

图3. 某一化合物不同晶型的XRPD对比图

3、评估物质的结晶度

当化合物结晶状态比较好、结晶度比较高时,XRPD图基线水平,峰形尖锐。反之,结晶度低时,基线不水平,出现漫散包,峰不尖锐,峰形宽化。

结晶度用来表示物相中结晶态物质所占的比例,同一种晶型,一般结晶度越高,熔点越高,如图4所示。

图4-同一晶型不同结晶度的XRPD对比图.jpg

图4.同一晶型不同结晶度的XRPD对比图

04 XRPD在晶型鉴别方面常见的问题

多数情况下,晶型的判断并不困难。只要其XRPD谱图一致(所有的衍射峰位置一致),就可以判断为同一晶型。但是在实际晶型鉴别中,我们也会经常遇到以下问题:

i:单一晶型还是混晶?
ii:相似的XRPD图,晶型是否一致?
iii:XRPD多峰或者少峰,晶型该如何判断?
iv:XRPD峰偏移,晶型该如何判断?
v:XRPD峰分叉晶型又该如何抉择?

i:单一晶型还是混晶?

1、培养单晶,通过和单晶模拟的粉末衍射图比对

单晶是判断晶型是否为单一晶型最直接的方法。通过培养目标晶型的单晶,然后通过单晶数据模拟XRPD谱图,与实测XRPD谱图进行对比。如果一致,则说明是单一晶型,如图5所示。

图5-某化合物单晶模拟和实测的XRPD对比图.jpg

图5. 某化合物单晶模拟和实测的XRPD对比图

2、通过不同的结晶方式,获得多批次样品的XRPD

若多批次重结晶实验(采用不同的结晶方式,不同的溶剂体系)获得样品的XRPD图一致,那么就可以认为是单一晶型,如图6所示。

图6-某化合物不同结晶方式获得的XRPD对比图.jpg

图6.某化合物不同结晶方式获得的XRPD对比图

3、结合不同表征技术进行全面的表征

DSC等辅助手段也可以用于是否单一晶型的判断。如果是单一晶型,那应该有单一的熔化峰。如果DSC检测有两个或者多个熔化峰,则有可能是混晶。NMR、TGA、KF等则可以对水合物、溶剂化物的情况进行判断。

4、晶型标准谱图对比

和对照品XRPD图对比,和专利文献报道的XRPD谱图对比,以确定当前制备的晶型是混晶还是单一晶型。

ii:相似的XRPD图,晶型是否一致?

同种物质(单一成分或者包含溶剂)的不同晶型可能晶体结构相似。比如无水物和水合物之间,不同含水量的水合物之间,无水物和溶剂合物之间,水合物和溶剂合物之间,不同的溶剂合物之间就可能晶型结构相似,简称isostructural。

此外,不同物质其实也可能具有相似的结构(即相似的XRPD图),比如氘代和非氘代化合物,异构体。对于这些情况,仅从XRPD图谱是很难判断的。需要结合项目背景信息,比如合成工艺,结晶工艺、化合物的多晶型情况,还需要结合其它表征手段综合分析,才能得到客观科学的结论,如图7-图9所示。

图7-氘代和非氘代的XRPD对比图.jpg

图7.氘代和非氘代的XRPD对比图

图8-对映异构体(苹果酸)的XRPD对比图.jpg

图8.对映异构体(苹果酸)的XRPD对比图

图9--某新药不同溶剂合物的XRPD对比图.jpg

图9.某新药不同溶剂合物的XRPD对比图

iii:XRPD多峰或者少峰,晶型该如何判断?

在进行晶型一致性判断时,少峰的情况(与标准品对比)相对问题较小,可以认为是该批次样品可能由于结晶情况与以往批次不同,导致某个或者某些晶面结晶度比较低,因而没有出峰。比较难判断的是XRPD谱图多峰的情况,出现多峰的情况,一定要引起重视。

多峰很可能有以下几种情况:
样品晶型不纯,不是单一晶型而是混晶;
样品未完全干燥,溶剂引起的多峰,尤其是在低角度多出的一些未知衍射峰,很可能是溶剂引起,建议干燥后再进行XRPD检测;
样品被污染,混入了外来物质(机械杂质和化学杂质),比如搅拌子的涂层PTFE脱落导致在18-19°有特征的衍射峰,化学杂质包括工艺相关杂质、异构体、无机盐等;
择优取向或者颗粒较大也是引起多峰或者少峰的最常见原因。择优取向体现在XPRD谱图上为有某个或者几个衍射峰强度非常高,其它的衍射峰相比则显得非常低,甚至不出峰。

择优取向常发生在片状和针状晶体。比较极端的情况,某些比较弱的衍射峰会消失,但对其研磨后衍射峰会出现。无论是片状晶体还是针状晶体,在研磨后,样品的形貌会趋向于不规则和随机的分布,此时每个晶面暴露在X射线下的概率也会趋向于一致,所以XRPD衍射峰就没有明显的择优取向。当然,研磨有可能会导致样品结晶度下降,甚至变为无定形,所以研磨时要注意研磨的强度和时间,如图10-图13所示。

图10-混晶引起的XRPD多峰图.jpg

图10.混晶引起的XRPD多峰图

图11-外来物引起的XRPD多峰图.jpg

图11.外来物引起的XRPD多峰图

图12-溶剂引起的XRPD多峰图.jpg

图12.溶剂引起的XRPD多峰图

图13-择优取向引起的XRPD多峰图.jpg

图13.择优取向引起的XRPD多峰图

iv:XRPD峰偏移,晶型该如何判断?

峰偏移经常发生在水合物脱水前后或者样品热处理前后的XRPD图上。非化学计量比水合物与对应的无水晶型具有相似的晶体结构,只有少数衍射峰有差异。脱水后,晶格收缩,晶面间距减小,导致衍射峰右移。

同样,温度对于XRPD的位置也有影响。热胀冷缩是一个物质的基本属性,同样适用于晶体。根据布拉格公式2d sin θ=n λ,温度升高,晶体膨胀,在波长不变的情况下,晶面间距d值增大,必然使sin θ 变小,即峰位左移。

另外,样品受到挤压,产生均匀的颗粒应变,比如压片,亦可能导致峰位右移。具体如图14和图15所示。

图14-水合物脱水引起的XRPD峰偏移图.jpg

图14.水合物脱水引起的XRPD峰偏移图

图15-受热和应力存在引起的XRPD峰偏移图.jpg

图15.受热和应力存在引起的XRPD峰偏移图

v:XRPD峰分叉晶型又该如何抉择?

在XRPD谱图分析时,如果遇到峰裂分等情况时,可能是颗粒表面粗糙度、颗粒太大、晶体结构缺陷等因素引起,研磨再测试可以解决大部分的问题。具体如图16所示。

图16--氯化钠不同颗粒大小引起的XRPD峰分叉图.jpg

图16.氯化钠不同颗粒大小引起的XRPD峰分叉图

05 z6尊龙的技术和服务

z6尊龙药物固态开发技术平台具有专业和经验丰富的盐型/共晶筛选、晶型筛选、单晶培养和结构解析、晶型定性定量研究团队。团队主要负责人曾担任多年的固态表征CNAS授权签字人,拥有10年以上固态表征分析技术经历,上百个API或制剂中API的晶型定性研究经验,能够为客户提供高效优质的固态表征技术服务,赋能您的药物开发。

参考文献

[1] 《中国药典》(2020年版)中0451 X射线衍射法
[2] 〈941〉 CHARACTERIZATION OF CRYSTALLINE AND PARTIALLY CRYSTALLINE SOLIDS BY X-RAY POWDER DIFFRACTION (XRPD).
[3] PECHARSKY V K, ZAVALIJ P Y. Fundamentals of Powder Diffraction and Structural Character of Materials [M]. Spring-er, 2005:161.

美研|CMC系列回顾

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